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Brief introduction of ordinary PCR
20世纪(ji)60年(nian)代末(mo)70年(nian)代初(chu)，人(ren)们(men)致(zhi)力于(yu)研究基(ji)因的体外分离技(ji)术(shu)(shu)。Khorana于(yu)1971年(nian)最早(zao)提出核酸体外扩(kuo)(kuo)增(zeng)的设想(xiang)。但是，当时的基(ji)因序列分析方法尚未(wei)成熟(shu)，对(dui)热(re)具有较强稳定性的DNA聚(ju)合(he)酶(mei)还未(wei)发(fa)现(xian)。1985年(nian)，美国科(ke)学(xue)家(jia)Kary Mullis发(fa)明(ming)了PCR技(ji)术(shu)(shu)，并在Science杂(za)志上发(fa)表了关(guan)于(yu)PCR技(ji)术(shu)(shu)的第一篇学(xue)术(shu)(shu)论文。从此(ci)，PCR技(ji)术(shu)(shu)得到(dao)了生(sheng)命(ming)科(ke)学(xue)界的普(pu)遍认同(tong)，Kary Mullis也因此(ci)而获(huo)得1993年(nian)的诺贝尔化学(xue)奖。1988年(nian)初(chu)，Keohanog通(tong)过(guo)对(dui)所使用的酶(mei)的改进，提高了扩(kuo)(kuo)增(zeng)的真实性。尔后，Saiki等(deng)人(ren)又从生(sheng)活在温泉(quan)中的水生(sheng)嗜热(re)杆菌(jun)内提取到(dao)一种耐(nai)热(re)的DNA聚(ju)合(he)酶(mei)，使得PCR技(ji)术(shu)(shu)的扩(kuo)(kuo)增(zeng)效率大大提高。
DNA的(de)半保留复制(zhi)是生(sheng)物进(jin)化和传(chuan)代的(de)重要途径。双链(lian)DNA在(zai)多种酶(mei)的(de)作用下(xia)(xia)可以变性解(jie)链(lian)成单链(lian)，在(zai)DNA聚合酶(mei)与(yu)启动(dong)子的(de)参与(yu)下(xia)(xia)，根据碱基互补配对原则复制(zhi)成同样的(de)两分(fen)子挎贝。
在聚合(he)酶链式反应实验中发现，DNA在高温时也可以发生变(bian)(bian)性(xing)(xing)(xing)解链，当温度降低后(hou)又可以复(fu)(fu)(fu)性(xing)(xing)(xing)成为双(shuang)链。因此，通过温度变(bian)(bian)化(hua)控制DNA的变(bian)(bian)性(xing)(xing)(xing)和复(fu)(fu)(fu)性(xing)(xing)(xing)，并设计(ji)引物做启动子，加入DNA聚合(he)酶、dNTP就可以完(wan)成特(te)定基因的体(ti)外复(fu)(fu)(fu)制。（ DNA高温变(bian)(bian)性(xing)(xing)(xing)低温复(fu)(fu)(fu)性(xing)(xing)(xing)）
发现耐热DNA聚合同(tong)(tong)酶#Taq酶对于PCR的(de)应用有里(li)程(cheng)碑的(de)意(yi)义，该(gai)酶可以耐受90℃以上(shang)的(de)高温(wen)而(er)不失活(huo)，不需要每个循环加酶，使PCR技(ji)术变(bian)得(de)(de)非常简捷、同(tong)(tong)时也大大降低了成(cheng)本，PCR技(ji)术得(de)(de)以大量应用，并(bing)逐(zhu)步应用于临床。
1、常(chang)规(gui)PCR结合电(dian)泳(yong)分(fen)析(xi)方法的缺点
2、只能对(dui)终产物进行分析(xi)，无法对(dui)起始模版准确定量
3、必(bi)须(xu)在扩(kuo)增反映结束后借助电泳方法(fa)分析(xi)，费(fei)(fei)时费(fei)(fei)事
4、无法(fa)对扩增反应实时检测(ce)
5、EB有毒
定(ding)义：在(zai)PCR反(fan)应体(ti)系中(zhong)加入荧光基团(tuan)，利用荧光信号的(de)变化，通过(guo)仪器软件(jian)实(shi)时检测PCR扩(kuo)(kuo)增(zeng)反(fan)应中(zhong)每一(yi)个循环扩(kuo)(kuo)增(zeng)产物量(liang)的(de)变化，通过(guo)Ct值和标准曲线实(shi)现对起始模板的(de)定(ding)量(liang)分析。
荧光(guang)探针法和荧光(guang)染(ran)料法。
→ PCR反应体(ti)系中加入荧(ying)光染料(liao)
→ 所有(you)的(de)(de)定量PCR仪器(qi)都有(you)三个共同的(de)(de)组成部分（检测(ce)器(qi)、激发光(guang)源、热(re)循环模块）
→ 在扩(kuo)增(zeng)过程(cheng)中，荧(ying)光信号随着(zhe)PCR产物的(de)增(zeng)加(jia)而(er)增(zeng)强
→ 每(mei)个循(xun)环结束后，定量(liang)PCR仪(yi)器(qi)通(tong)过光学系统(tong)记录荧光信号(hao)的增(zeng)加(jia)
→ PCR软件计(ji)算出(chu)数据，用于实(shi)验结果的分析
→ 苏州旷远产品技术平(ping)台：ARMS检测方法(fa)；1个SNP位(wei)点设计(ji)双(shuang)管反(fan)应，含目的(de)基因检测及(ji)内参检测双(shuang)通道。
→准确可靠(kao)，临床双(shuang)盲对照试验＞1000例，结果(guo)与金标准测序法比对，结果(guo)一致性(xing)大于99%。
→ 高灵敏：可检测(ce)低(di)至10ng的人(ren)基因组DNA。
→快速：整(zheng)个检测流程只(zhi)需3小(xiao)时。
→简(jian)便：试(shi)剂(ji)盒(he)提供(gong)预混(hun)好的试(shi)剂(ji)，使体(ti)系配(pei)置操(cao)作简(jian)便。
→防污染
→高特(te)(te)异性(xing)(xing)(xing)：双重特(te)(te)异性(xing)(xing)(xing)组成，保证检(jian)测结(jie)果的(de)特(te)(te)异性(xing)(xing)(xing)和(he)准确性(xing)(xing)(xing)引物与(yu)DNA互补链结(jie)合必需完全配(pei)对(dui)，才(cai)能延伸。探(tan)针特(te)(te)异性(xing)(xing)(xing)与(yu)所检(jian)测基因的(de)PCR产物配(pei)对(dui)，在(zai)延伸中产生(sheng)荧(ying)光(guang)。
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方法 |
原理 |
适用 |
优点 |
弱点 |
操作 |
准确性 |
市场应用 |
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DNA芯片 |
PCR-芯片杂交 |
多位点 |
多基因，多为点同时 |
少数位点 |
步骤多，易污染 |
较高 |
临床使用 |
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PCR-RFLP |
PCR-酶切-电泳 |
SNP位点 |
无 |
多位点 |
步骤多，易污染 |
较高 |
逐步淘汰 |
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Sanger测序 |
PCR-测序 |
SNP位点，缺失突(tu)变(bian) |
时间长 |
步骤多 |
金标准 |
无注册证 |
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PCR-荧光染料法 |
荧光PCR |
单个基因 |
快速，简便 |
假阳性 |
简单一步 |
高 |
核酸检测 |
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PCR-荧光探针法 |
Taqman |
SNP，多态性 |
快速，简便 |
少数位点 |
简单一步 |
高 |
普及 |
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液相芯片法 |
PCR-液相杂交 |
SNP, 多基因(yin)，多位点 |
易污染 |
步骤多 |
较高 |
非主流 |
