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Brief introduction of ordinary PCR
20世纪(ji)60年代(dai)末70年代(dai)初，人们致力于(yu)研究基因的(de)(de)(de)(de)体外分(fen)离技术(shu)(shu)。Khorana于(yu)1971年最(zui)早(zao)提(ti)出核酸体外扩增(zeng)的(de)(de)(de)(de)设想。但是，当时的(de)(de)(de)(de)基因序列分(fen)析方法尚未成熟，对热具(ju)有较强稳定(ding)性(xing)的(de)(de)(de)(de)DNA聚合(he)酶还未发现。1985年，美(mei)国科学(xue)(xue)家Kary Mullis发明了(le)PCR技术(shu)(shu)，并在Science杂志上发表了(le)关于(yu)PCR技术(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)第(di)一篇学(xue)(xue)术(shu)(shu)论文。从此，PCR技术(shu)(shu)得到了(le)生(sheng)命科学(xue)(xue)界的(de)(de)(de)(de)普遍认同，Kary Mullis也因此而获得1993年的(de)(de)(de)(de)诺(nuo)贝尔化学(xue)(xue)奖(jiang)。1988年初，Keohanog通过对所使(shi)用的(de)(de)(de)(de)酶的(de)(de)(de)(de)改(gai)进，提(ti)高了(le)扩增(zeng)的(de)(de)(de)(de)真实性(xing)。尔后，Saiki等人又从生(sheng)活在温泉中(zhong)的(de)(de)(de)(de)水生(sheng)嗜热杆(gan)菌内提(ti)取到一种耐热的(de)(de)(de)(de)DNA聚合(he)酶，使(shi)得PCR技术(shu)(shu)的(de)(de)(de)(de)扩增(zeng)效(xiao)率大(da)大(da)提(ti)高。
DNA的(de)(de)半(ban)保留复制是生物进化(hua)和传代的(de)(de)重要(yao)途(tu)径。双链(lian)DNA在多(duo)种酶(mei)的(de)(de)作(zuo)用下可以变(bian)性解链(lian)成单链(lian)，在DNA聚合酶(mei)与启(qi)动子的(de)(de)参与下，根据碱基互补配对原(yuan)则复制成同样的(de)(de)两分(fen)子挎(kua)贝。
在(zai)聚合酶链式(shi)反应实验中(zhong)发现，DNA在(zai)高温(wen)时也可以发生变性解链，当温(wen)度降低后又可以复性成(cheng)为(wei)双链。因此，通过温(wen)度变化控制DNA的变性和复性，并设计(ji)引物做启动子，加入(ru)DNA聚合酶、dNTP就可以完成(cheng)特(te)定基因的体外复制。（ DNA高温(wen)变性低温(wen)复性）
发现耐(nai)热DNA聚合同酶(mei)#Taq酶(mei)对于PCR的(de)应(ying)用(yong)有(you)里程(cheng)碑的(de)意(yi)义，该(gai)酶(mei)可以(yi)(yi)耐(nai)受90℃以(yi)(yi)上的(de)高温(wen)而不(bu)失活，不(bu)需要每(mei)个循环加酶(mei)，使PCR技术(shu)变得非常简捷、同时也大大降低了成(cheng)本，PCR技术(shu)得以(yi)(yi)大量应(ying)用(yong)，并逐步应(ying)用(yong)于临床。
1、常规PCR结(jie)合电泳分析(xi)方法的缺点
2、只能对终产物进(jin)行分析，无法对起(qi)始(shi)模版准确定量
3、必须在扩增反映结束后借助电泳方法(fa)分(fen)析，费时费事
4、无法对扩增反(fan)应实(shi)时检测
5、EB有毒
定(ding)义：在PCR反(fan)应(ying)(ying)体系中加入荧(ying)光基团，利用荧(ying)光信(xin)号的(de)(de)变化，通(tong)(tong)过(guo)仪器软(ruan)件实时检测PCR扩增反(fan)应(ying)(ying)中每一个循环扩增产物量的(de)(de)变化，通(tong)(tong)过(guo)Ct值和(he)标准曲(qu)线实现(xian)对起始模板的(de)(de)定(ding)量分析。
荧光探针法和荧光染(ran)料法。
→ PCR反(fan)应体(ti)系中加(jia)入(ru)荧光染(ran)料
→ 所有的(de)定量(liang)PCR仪器都有三个共同(tong)的(de)组(zu)成(cheng)部分（检(jian)测器、激发光源、热循环模(mo)块）
→ 在扩增过程中，荧光信号随着PCR产物的增加(jia)而增强
→ 每(mei)个循环结束后，定量(liang)PCR仪器通(tong)过光学系(xi)统记(ji)录荧光信号的增加
→ PCR软件计算出数(shu)据，用于实(shi)验结果的(de)分析
→ 苏(su)州旷远(yuan)产品技术平台：ARMS检(jian)测(ce)方法；1个SNP位点设计(ji)双管反应，含目的基(ji)因检(jian)测(ce)及内参检(jian)测(ce)双通道。
→准确(que)可靠，临床双盲对照试验＞1000例，结(jie)果与金标准测序法比对，结(jie)果一致性(xing)大于99%。
→ 高灵敏：可检测(ce)低至10ng的人(ren)基因组DNA。
→快(kuai)速：整个(ge)检测(ce)流(liu)程只(zhi)需(xu)3小(xiao)时(shi)。
→简(jian)便：试剂盒提供预(yu)混(hun)好的(de)试剂，使体系配置(zhi)操(cao)作(zuo)简(jian)便。
→防污染
→高特(te)异(yi)性(xing)(xing)：双重(zhong)特(te)异(yi)性(xing)(xing)组成，保证检(jian)测(ce)结果的特(te)异(yi)性(xing)(xing)和准确性(xing)(xing)引物与DNA互(hu)补链结合必需完全配对(dui)，才能延(yan)伸。探(tan)针特(te)异(yi)性(xing)(xing)与所检(jian)测(ce)基(ji)因的PCR产物配对(dui)，在(zai)延(yan)伸中产生荧光。
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方法 |
原理 |
适用 |
优点 |
弱点 |
操作 |
准确性 |
市场应用 |
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DNA芯片 |
PCR-芯片杂交 |
多位点 |
多基因，多为点同时 |
少数位点 |
步骤多，易污染 |
较高 |
临床使用 |
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PCR-RFLP |
PCR-酶切-电泳 |
SNP位点 |
无 |
多位点 |
步骤多，易污染 |
较高 |
逐步淘汰 |
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Sanger测序 |
PCR-测序 |
SNP位点，缺(que)失突变 |
时间长 |
步骤多 |
金标准 |
无注册证 |
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PCR-荧光染料法 |
荧光PCR |
单个基因 |
快速，简便 |
假阳性 |
简单一步 |
高 |
核酸检测 |
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PCR-荧光探针法 |
Taqman |
SNP，多态性 |
快速，简便 |
少数位点 |
简单一步 |
高 |
普及 |
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液相芯片法 |
PCR-液相杂交 |
SNP, 多基(ji)因，多位点 |
易污染 |
步骤多 |
较高 |
非主流 |
